شناسایی سریع Clostridium perfringens تایپ‌هایA، B،C، D به روش Multiplex PCR

نوع مقاله: مقاله کامل

نویسندگان

1 دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا... (عج)- مرکزتحقیقات بیوتکنولوژی کاربردی و محیط زیست

2 گروه علوم زیستی، دانشگاه امام حسین(ع)

3 مؤسسه سرم و واکسن سازی رازی کرج

چکیده

 Clostridium perfringens بخشی از فلور طبیعی خاک می‌باشد و گزارشات متعددی از جدا شدن این ارگانیسم از مواد غذایی خام و پخته وجود دارد. این باکتری به پنج تایپ A تا E تقسیم شده است و این تقسیم بندی بر اساس تولید سم آلفا، بتا، اپسیلون و یوتا می‌باشد. در این مطالعه از واکنش multiplex PCR جهت شناسایی باکتری Cl. perfringens تایپ‌هایA, B,C, D استفاده شد. تائید اولیه تیپ‌های باکتریایی مورد استفاده با روش بیوشیمیایی و سرولوژیکی صورت گرفت. جهت شناسایی بوسیله PCR، چهار جفت پرایمر با دمای ذوب نزدیک به هم طراحی گردید. قطعات تکثیر یافته برای تیپ‌ A، 1167 جفت باز (سم آلفا) و برای تیپ‌ B، 1167 و 1025 و 961 جفت باز (سم آلفا، سم بتا و سم اپسیلون) و برای تیپ‌ C، 1167 و 1025 جفت باز (سم آلفا و سم بتا) و برای تیپ‌ D، 1167 و 961 جفت باز (سم آلفا و سم اپسیلون) بود. جهت بررسی ویژگی واکنش از باکتری Cl. botulinum به عنوان کنترل منفی استفاده شد که نتایج PCR آن با پرایمرهای طراحی شده منفی بود. نتایج این تحقیق نشان داد که شناسایی کلستریدیوم پرفرنجنس با استفاده از multiplex PCR بسیار ساده، حساس، اختصاصی و در حداقل زمان بوده و می‌توان جهت تعیین تایپ‌های A, B,C, D Cl. perfringens استفاده نمود.

عنوان مقاله [English]

Fast detection of Clostridium perfringens Type A,B,C and D by Multiplex PCR

نویسندگان [English]

  • ئ Saadati 1
  • M Kamali 1
  • M.B Salehi 1
  • M Tavalaei 1
  • GH.R Olad 2
  • M Musavi 3
1 Biology Department, Basic Science Research Center, Imam Houssein University
2 Biology Department, Basic Science Research Center, Imam Houssein University
3 Department of Anaerobiology, Razi Serum and Vaccine Institute, Karaj
چکیده [English]

Clostridium perfringens is a part of the microflora of soil, and many reports have revealed the widespread occurrence of this organism in raw and processed foods. C. perfringens is classified into five types (types A to E), depending upon their ability to express alpha, beta, epsilon, and iota toxins In this study, a multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for detection of C. perfringens types A, B, C and D. These strains have formerly been confirmed by the biochemical methods as well as serological test. For detection by PCR, four primer pairs with equal melting temperatures, were designed. DNA amplification fragments of 1167 bp for C. perfringens type A alone (α toxin), 1167 bp, 1025 bp and 961 bp for C. perfringens type B (α, β and ε toxin) 1167 bp and 1025 bp for C. perfringens type C (α and β toxin), and 1167 bp and 961 bp for C. perfringens type D (α and ε toxin) were obtained. Clostridium botulinum ued as negative control and did not yield a PCR product. These findings suggest that the assay is easy, timesaving, sensitive and specific and can use for detection of A, B, C and D types of C. perfringens.

1-       اولاد غ، سعادتی م، کمالی م، تولایی م، پیله چیان و موسوی (1383) شناسایی و تعیین تایپ کلستریدیوم پرفرنجنس تایپ B بروش PCR . دومین همایش سراسری در برابر عوامل بیولوژیک.

2-        سعادتی م، اولاد غ، کمالی م، تولایی م، پیله چیان و موسوی (1383) شناسایی و تعیین تایپ کلستریدیوم پرفرنجنس تایپ C بروش PCR : دومین همایش سراسری در برابر عوامل بیولوژیک.

 

3- Augustynowicz, E., Gzyl, A. & lusarczyk, J. (2000) Molecular epidemiology survey of toxinogenic Clostridium perfringens strain types by multiplex PCR. Scand. J. Infect. Dis. 32, pp. 637–641.

4- Baums C. G., Schotte U., Amtsberg G &Goethe R. (2004) Diagnostic multiplex PCR for toxin genotyping of Clostridium perfringens isolates. Veterinary Microbiology 20 May, Pages 11-16

5- Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. (1989) Volume 2 1179-1182.

6- Brana, K. 1999. Development and evaluation of various enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of Clostridium perfringenes, anti-toxins. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 24; 293-297.

7- Daube. G., China. B., Simon. P., Hvala. K. & Mainil. J. (1994) Typing of Clostridium perfringens by in vitro amplification of toxin genes. Jounal of Applied Bacteriology 77,650-655

8- Garmory, H.S., Chanter, N., French, N.P., Bueschel, D., Songer, J.G. & Titball, R.W. (2000) Occurence of Clostridium

perfringens β2-toxin amongst animals, determined using genotyping and subtyping PCR assays. Epidemiol. Infect. 124, pp.

61–67.

9- Heikinheimo A, Korkeala H. (2005) Multiplex PCR assay for toxinotyping Clostridium perfringens isolates obtained from

Finnish broiler chickens. Lett Appl Microbiol.;40(6):407-11

10- Julan. I. R. & Stewart. T. C. (1991) Molecular Genetics and Pathogenesis of Clostridium perfringenes. Microbiological Reviews. 621-648.

11- Kanakarj. R., Harris. D. L., Songer. J. G. & Bosworth. B. (1998) Multiplex PCR assay for detection of Clostridium perfringens in feces and intestinal contents of pigs and in swine feed. Vet. Microbiology, 63, 29-38

12- Meer. R. R. & Songer. J. G. (1997) Multiplex polymerase chain reaction assay for genotyping Closreidium perfringenes.

AJVR, 58, 702-70

13- McClane, B.A. (1996) An overview of Clostridium perfringens enterotoxin. Toxicon 34, pp. 1335–1343.

14- McClane, B. A. (2001) Clostridium perfringens, p. 351-372. In L. R. Beuchat, M. P. Doyle, and T. J. Montville ed., Food microbiology: fundamentals and frontiers, 2nd ed. ASM Press, Washington, D.C.

15- McCourt M. T, Finlay D. A, Laird C, Smyth J. A, Bell C, Ball H. J. (2005) Sandwich ELISA detection of Clostridium perfringens cells and alpha-toxin from field cases of necrotic enteritis of poultry.Vet Microbiol;106: 259-64

16- Miyamoto, K., Wen Q. & McClane, B. A. (2004) Multiplex PCR genotyping assay that distinguishes between isolates of

Clostridium perfringens type a carrying a chromosomal enterotoxin gene cpe locus, a plasmid cpe locus with an is1470-like

sequence, or a plasmid cpe locus with an is1151 sequence. J Clin Microbiol. 424: 1552–1558.

17- Nagahama, M., Kobayashi, K., Ochi, S. & Sakurai, J. (1991) Enzyme-linked immunosorbent assay for rapid detection of toxins from Clostidium perfringens. FEMS Microb. Lett. 84: 41-44

18- Naylor, R. D., Martin, P. K. & Sharpe, R. T. (1987)Dtection of Clostidium perfringens epsilon toxin by ELISA. Res.Vet. Sci. 42: 255-256.

19- Newton. C. R. & GRAHAM. A. (1994) PCR. Oxford, bios, Scientific Publisher

20- Petit. L., Gibeert. M. & Popoff. M. R. (1999) Clostridium perfringenes: toxinotype and genotype. Trends Microbiol; 73

104-110

21- Sakuri. J. (1999) Hemorrhagic enteritis associated with Clostridium perfringenes type A in a dog. J. Vet. Med. Sci.

61:175-177

22- Sakuri. J. & MEER. R. R. (1996) Genotyping of Clostridium perfringenes by Polymerase Chain Reactions is a useful adjunct to diagnosis of clostridial enteric disease in animals. Anaerobe 2: 17-22

23- Songer, J. G. (1996) Clostridial enteric diseases of domestic animals. Clin. Microbiol. Rev. 9:216-234

24- Songer, J.G. & Meer, R.R. (1996) Genotyping of Clostridium perfringens by polymerase chain reaction is a useful adjunct to diagnosis of clostridial enteric disease in animals. Anaerobe, 197–203.

25- Sterne, M., Batty, I. (1975) Pathogenic Clostridia. Butterworths, London, pp. 79–122.

26- Thiede, S., Goethe, R. & Amtsberg, G. (2001) Prevalence of beta2 toxin gene of Clostridium perfringens type A from diarrhoeic dogs. Vet. Rec. 149, 273–274.

27- TOPLY & Wilson, S. (1998) Principles of bacteriology virology and immunity. Vol 2: systematic bacteriology. Chapter 32:Clostridium: the spore-bearing anaerobes. Hatheway C. L., and Johnson E. A., Edward Aruold, 732-785.

28- Twetwn. R. K. (2001) Clostridium perfringenes beta toxin and Clostridium septicum alpha toxin: Their mechanisms possible role in pathogenesis. Vet. Microbiology, 82 ,1-9

29- Uzal FA, Plumb JJ, Blackall LL, O’Boyle D, Kelly WR. (1996) Detection by polymerase chain reaction of Clostridium

perfringens producing epsilon toxin in faeces and in gastrointestinal contents of goats. Lett Appl Microbiol. 23(1):13-7.

30- Yoo.H. S., Lee. S. U., Park. K. Y. & Park. Y. H. (1997) Molecular typing and epidemiological survey of prevalence of

Clostridium perfringens types by Multiplex PCR. Journal of clinical  microbiology, 228-232

31- Wen, Q. & McClane B. A. (2004) Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens Type A isolates in American retail foods. Appl Environ Microbiol. 705: 2685–2691.

32- Wolfgang. K. & Jokli K. (1986) Zinsser microbiology. 20th edition. Appleton and Lange. Chapter 44: Closteridium.: 636-657.

33- Zynkind & Bernsrtein. (1992) Rcombinant DNA Laoratory Manual , Protocols