تشخیص عفونت ویروسی لوسمی گاو با استفاده از روش Nested-PCR

نویسندگان

گروه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران

چکیده

ویروس لکوز گاو ( BLV ) رترو ویروسی است که موجب لکوز یا لمفومای مزمن  گاو در بسیاری از کشورهای جهان می‌شود. الیزا اولین روش تشخیصی برای غربالگری حضور پادتن ها بر علیه ویروس لکوز گاوی است. تا کنون روشن نشده است که آیا این روش پادتن ها را در زمان آلودگی به ویروس لوسمی گاو شناسایی می‌کند یا خیر. واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) برای توالی‌های اختصاصی DNA پروویروس هدف، در سلول های تک هسته ای خون محیطی (PBML) استفاده شده است. به منظور یافتن روشی حساس و کارا برای تشخیص آلودگی به ویروس BLV در نمونه‌های خون و بافت‌ها یا محتواهای مختلف، روش آشیانه‌ای واکنش زنجیره ای پلی مراز (Nested-PCR) بر اساس شناسایی ژن BLV-gag طراحی گردید. آزمون آشیانه ای PCR بر روی نمونه‌های اخذ شده از گاوهایی که به صورت طبیعی آلوده شده‌اند (281 نمونه)، نمونه‌های بافتی پارافینی(3 نمونه) و DNAی تخریب شده (10 نمونه عقده لمفاوی سونیکه) انجام شد. حساسیت و ویژگی آزمون  PCR به ترتیب 85/0 و 84/0محاسبه گردید. درجه توافق بین دو آزمون (کاپا) مقدار 693/0 محاسبه گردید که قابل توجه است. ارزش پیشگویی مثبت آزمون (دقت) 82/0 و ارزش پیشگویی منفی آن 86/0 بود . در نهایت صحت آزمون 85/0 محاسبه شد. این مطالعه نشان داد که روش واکنش زنجیره ای پلی مراز آشیانه‌ای در مقایسه با روش های PCR معمولی استفاده شده در آزمایش های متفاوت از حساسیت بیشتری برخوردار است.  این تکنیک برای غربالگری انبوه و همچنین تشخیص DNA پروویروس در نمونه های بافتی خاص اعم از پارافینه یا نمونه های قدیمی مفید خواهد بود.  

عنوان مقاله [English]

Detection of bovine leukemia virus infection by Nested-PCR analysis

نویسندگان [English]

  • لا.ق Nikbakht Brouje
  • S.M Emam
  • H Rezaei
Microbiology Department, Veterinary Faculty of Tehran University
چکیده [English]

Bovine leukemia virus (BLV) is a retrovirus causing a chronic leukemia/lymphoma in cattle in many countries around the world. Screening for antibodies by Elisa has been the primary means of detecting the presence of this virus. It is not yet known if this assay will detect antibodies in all cattle during a concomitant bovine leukemia virus infection. The polymerase chain reaction (PCR) of the target proviral DNA in peripheral blood mononuclear cells (PBML). In order to find a highly sensitive and efficient method for the diagnosis of BLV infection in different matrices as well as blood samples, we have designed a Nested-PCR method to detect BLV-gag proviral DNA in naturally infected cattle together with paraffin embedded blocks and degraded DNAs. Samples of natural infected cows (n=281), paraffin embedded (n=3) and degraded DNA (n=10) were examined. When using ELISA as a reference test, sensitivity and specificity for nested PCR were 0.85 and 0.84, respectively. Interpretation of kappa scores for two methods was substantial (0.693). Predictive value of a positive test was 0.82, and predictive value of a negative test was 0.86. The percentage of cows correctly classified by nested PCR assay was 85%.  This strategy have shown to allow detection at different experiments and had higher sensitivity in comparison with normal PCR. This latter technique is useful for mass screening and could be useful to detect proviral DNA in paraffin embedded or old samples.

1- تاج بخش، ح، (1374) ایمنی شناسی بنیادی .چاپ ششم. انتشارات دانشگاه تهران، تهران، 680 صفحه. ##

2- کیوانفر، ه، کریمی، ن،  (مترجمین)،(1376) ویروس شناسی دامپزشکی (بخش بیماری ها)، انتشارات دانشگاه تهران، تهران، 455 صفحه. ##

3- Agresti, A., Ponti, W., Rocchi, M., Meneveri, R., Maozzi, A., Cavallri, D., Peri, E., Polli, G. and Ginelli, E. (1993) Use of polymerase chain reaction to diagnosis bovine leukemia virus infection in calves at birth. Am. J. Vet. Res. 54: 373-378 ##

4- Barrie, K., Perez, E., Lamers, S., Farmerie, W., Dunn, B., Sleasman, J. and Goodenow, M. (1996) Natural variation in HIV-1 protease, Gag p7 and p6, and protease cleavage sites within gag/pol polyproteins: amino acid substitutions in the absence of protease inhibitors in mothers and children infected by human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 219: 407-416##

5- Bazargani, T. T., Barin, A. and Hadadzadeh, H. (1987) A survey on frequency of infection to the virus of enzootic bovine leucosis in dairies around Tehran. XXIII Veterinary world congress . 169##

6- Bicka, L., Kuzmak, J., Kozaczynska, B., Plucienniczak, A. and Skorupska, A. (2001) Expression of bovine leukemia virus protein p24 in Escherichia coli and its use in the immunoblotting assay. Acta. Biochim. Pol. 48: 227-232##

7- Blood, D. C. and Radostits, O. M., (2002) Veterinary Medicine. Bailliere .Tindall. London. pp.1046-1058.##

8- Bunger , I., Khalaf, H. and M. Rimpler, (1996) Examination of antigen preparations from the virus of enzootic bovine leukosis with regard to suitability for immunoblotting. Dtsch Tierarztl Wochenschr. 103: 516-519.##

9- Burny, A., Cleuter, Y., Kettmann, R., Mammerickx, M., Marbaix, G., Portetelle, D., van den Broeke, A., Willems, L. and Thomas, R. (1988) Bovine leukaemia. facts and hypotheses derived from the study of an infectious cancer. Vet Microbiol. 17: 197-218. ##

10- Choi, K., Liu, R. and Buehring, G. (2002) Relative sensitivity and specificity of agar gel immunodiffusion, enzyme immunosorbent assay, and immunoblotting for detection of anti-bovine leukemia virus antibodies in cattle. J. Virol. Methods. 104: 33-39.##

11- Deshayes, L., Levy, D., Parodi, A. and Levy, J. (1977)  Proteins of bovine leukemia virus. I. Characterization and reactions with natural antibodies. J. Virol. 21: 1056-1060.##

12- Fechner, H., Kurg, A., Geue, L., Blankenstein, P., Mewes, G., Ebner, D. and Beier, D. (1996) Evaluation of polymerase chain reaction (PCR) application in diagnosis of bovine leukaemia virus (BLV) infection in naturally infected cattle. Zentralbl Veterinarmed B. 43:621-630.##

13- Gonzalez, E., Oliva, G., Norimine, J., Cid de la Paz, V. and Echeverr, M. (1998) Evaluation of western blotting for the diagnosis of enzootic bovine leukemia. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 51: 299-305.##

14- Gutierrez, S. E, Dolcini, G. L., Arroyo, G. H., Rodriguez, D. C., Ferrer, J. F.,and Esteban, E. N. (2001) Development and evaluation of a highlt sensitive and specific blocking enzyme-linked immunosorbant assay and polymerase chain reaction assay for diagnosis of bovine leukemia virus infection in cattle. Am. J. Vet. Res.62:1571-1577##

15- Kittelberger, R., Reichel, M., Meynell, R., Tham, K. and Molloy, J. (1999) Detection of antibodies against the core protein p24 of the bovine leukaemia virus in cattle for confirmatory serological testing. J. Virol. Methods. 77: 109-14.##

16- Landis, J. R., and Koch, G. G. (1977) The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics 33: 159-174.##

17- Licursi, M., Inoshima, Y., Wu, D., Yokoyama, T., Gonzalez, E. and Sentsui, H. (2002) Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts. Virus Res. 86: 101-110.##

18- Martin, D., Arjona, A.,Soto, I., Barquero, N.,Viana, M. and Gomez-Lucia, E. (2001) Comparative study of PCR as a direct assay and ELISA and AGID as indirect assay for the detection of bovine leukemia virus. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health. 48: 97-106##

19- Monke, D. R.,Rohde, R. F, Hueston, W. D.and R. J. Milburn, (1992) Estimation of the sensitivity and specificity of the agar gel immunodiffusion test for bovine leukemia virus:1,296cases (1982-1989) J. Am. Vet. Med. Assoc. 200: 2001-2004##

20- Murphy, A. ,Gibbs, J., Horzinek, C. and Studdert, J. (1999)Vet. virol. Academic Press, California, USA. PP: 363-373, 383-384##

21- Naif, H. M., Brandon, R. B., Daniel, R. C. and Lavin, M. F. (1990) Bovine leukaemia proviral DNA detection in cattle using the polymerase chain reaction. Vet. Microbiol. 25: 117-129.##

22- Naif, H. M., Daniel, R. C., Cougle, W. G. and Lavin, M. F. (1992) Early detection of bovine leukemia virus by using an enzyme-linked assay for polymerase chain reaction-amplified proviral DNA in experimentally infected cattle. J. Clin. Microbiol. 50: 675-679.##

23- Roberts, D. H., Lucas, M. H., Wibberley, G. and Chasey, D. (1990) Survival of bovine leukosis virus in bovine hole blood,serum and plasma. J. Biol. Stand. 9: 469-473##

24- Rola, M. and Kuzmak, J. (1999) The detection of bovine leukemia virus proviral DNA by PCR-ELISA. J. Virol .Methods. 99: 33-40##

25- Tajima, S. and Aida, Y. , (2002) Mutant tax protein from bovine leukemia virus with enhanced ability to activate the expression of c-fos. J. Virol. 76: 2557-2562.##

26- Tajima, S., Takahashi, M., Takeshima, S., Konnai, S., Yin, S.A., Watarai, S., Tanaka, Y., Onuma, M., Okada, K. and Aida, Y., (2003) A mutant form of the tax protein of bovine leukemia virus (BLV), with enhanced transactivation activity, increases expression and propagation of BLV in vitro but not in vivo.  J. Virol. 77: 1894-1903.##