بررسی هم‌خوانی دو نوع پرایمر RT-PCR جهت تشخیص ویروس آنفلوانزای پرندگان (H9N2)

نوع مقاله: مقاله کامل

نویسندگان

1 گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهر قدس، شهرقدس، ایران

2 گروه میکروبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، کرج، ایران

3 گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، کرج، ایران

چکیده

هدف از انجام این تحقیق استفاده از دو نوع پرایمر RT-PCR برای تشخیص ویروس آنفلوانزای H9N2 پرندگان و مقایسه هم‌خوانی این دو روش نسبت به همدیگر بود تا مشخص شود کدام روش در رقت‌های متوالی تهیه شده دارای آستانه تشخیص بیشتری است. برای این منظور میزان EID50 ویروس آنفلوانزایی که با استفاده از کشت و کیت‌های تجاری مورد تایید قرار گرفته بود، با استفاده از روش Reed and Muench مشخص شد. تیتر ویروس 106  EID50 در میلی‌لیتر بود. از ویروس آنفلوانزای مذکور اقدام به تهیه رقت بر اساس لگاریتم دو شد و با استفاده از کیت RNA Pure ساخت شرکت سیناژن اقدام به خالص‌سازی ژنوم موجود در نمونه‌های رقیق شد. پس از تهیه cDNA برای تشخیص ویروس آنفلوانزا از پرایمرهای منتشر شده در مقالات Wu et al. 2008 و Spackman et al. 2002 استفاده شد. واکنش‌های RT-PCR برای تشخیص ژن ماتریکس (M) ویروس آنفلوانزای پرندگان بود که هر کدام به ترتیب قطعاتی به اندازه 131 و 100 جفت باز را تشخیص می‌دهند. همچنین برای اطمینان از اختصاصی بودن دو جفت پرایمر مذکور از نمونه ویروس‌های واکسن برونشیت H120 و ویروس واکسن نیوکاسل B1 به عنوان کنترل منفی استفاده شد. هر دو روش نسبت به تشخیص ویروس آنفلوانزا اختصاصی بودند و هیچ کدام از روش‌های مذکور در مورد ویروس برونشیت و نیوکاسل باند تشکیل ندادند. روش  Wu et al. 2008 تا رقت 1:4096 و 168 کپی از ژنوم در میلی‌لیتر و روش Spackman et al. 2002 تا رقت 1:2048 و 336 کپی از ژنوم در میلی‌لیتر توانستند مشخص کنند. لذا پرایمرهای مربوط به روش  Wu et al. 2008 حساس‌تر از روش دیگر می‌باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Correlation between Two RT-PCR Primers in Detection of Avian Influenza Viruses (H9N2)

نویسندگان [English]

  • Kamran Mohammad Bagher pour 1
  • Hadi Pour Taghi 2
  • Hossein Hosseini 3
1 Department of Microbiology, College of basic sciences, Shahre Qods branch of Islamic Azad University, Shahre Qods, Iran
2 عضو هیات علمی تمام وقت دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج
3 Department of Clinical Science, College of veterinary medicine, Karaj branch of Islamic Azad University, Karaj, Iran
چکیده [English]

The goal of current study was comparison of two RT-PCR primers in detection of H9N2 influenza viruses. We compare correlation between two methods to determine which method in serial dilution can detect more samples. First, EID50 of an avian influenza virus was calculated by Reed-Muench method. The titer of virus was 106 EID50/ml. Then, we prepare two fold serial dilution of virus. Then, genome was extracted by RNA Pure kit (Cinna-Gene, Iran). Two separate one step RT-PCR methods were used to detection of avian influenza virus (Wu et al. 2008 and Spackman et al. 2002). Target gene of both methods was matrix (M) gene. Product size that produced by both methods were 131 bp and 100 bp respectively. To ensure about specifity of two RT-PCR primers, we used H120 vaccine and B1 vaccine as negative control. Both methods were specific to avian influenza virus and none of them did not produce any amplicons when used other respiratory disease viruses as template. The Wu et al, 2008 primers was able to detect avian influenza virus to 1:4096 and 168 copy number/ml but, Spackman et al, 2000 primers was only able to detect 1:2048 and 336 copy number/ml. So, the Wu et al, 2008 primers was more sensitive method in detection of avian influenza viruses.

کلیدواژه‌ها [English]

  • avian influenza virus
  • H9N2
  • Correlation

1- Capua, I., Alexander, D, J. (2007). Avian influenza infections in birds - a moving target. Influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses 1:11-18.
2- Cattoli, G., Drago, A., Maniero, S., Toffan, A., Bertoli, E., Fassina, S., Terregino, C., Robbi, C., Vicenzoni, G., Capua, I. (2004). Comparison of three rapid detection systems for type A influenza virus on tracheal swabs of experimentally and naturally infected birds. Avian Pathology 33(4):432-437.
3- Chatziprodromidou, I, P., Arvanitidou, M., Guitian, J., Apostolou, T., Vantarakis, G., Vantarakis, A. (2018). Global avian influenza outbreaks 2010-2016: a systematic review of their distribution, avian species and virus subtype. BioMed Central 7(17):1-12.
4- Fouchier, R, A., Bestebroer, T, M., Herfst, S., Kemp, L, V, D., Rimmelzwaan, G, F., Osterhaus, A, D, M, E. (2000). Detection of influenza A viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene. Journal of Clinical Microbiology 38(11):4096-4101.
5- Graentzdoerffer, A., Nemetz, C. (2003). Titration of non-occluded baculovirus using a cell viability assay. BioTechniques 34:260-264.
6- Kyoung, C, H., Park, J, H., Song, M., Oh, T., Kim, S., Kim C., Kim, H., Sung, M., Han H., Hahn, Y., Choi, Y. (2008). Development of multiplex RT-PCR assays for rapid detection and subtyping of influenza type A viruses from clinical specimens. Journal of Microbiology and Biotechnology 18(6):1164-1169.
7- Maclachlan, N, J., Dubovi, E, J. (2011). Virus replication. In: Fenner veterinary virology, Chapter 2, Academic Press.
8- Nakamura, S., Katamine, S., Yamamoto, T., Foung, S., Kurata, T., Hirabayashi, Y., Shimada, K., Hino, S., Miyamoto, T. (1993). Amplification and detection of a single molecule of human immunodeficiency virus RNA. Virus Genes 4:325-338.
9- Sakurai, A., Shibasaki, F. (2012). Updated values for molecular diagnosis for highly pathogenic avian influenza virus. Viruses 4:1235-1257.
10- Spackman, E., Senne, D, A., Myers, T, J., Bulaga, L, L., Garber, L, P., Perdue, M, L., Lohman, K., Daum, L, T., Suarez, D, L. (2002). Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. Journal of Clinical Microbiology 40(9):3256-3260.
11- Spackman, E., Senne, D, A., Bulaga, L, L., Trock, S., Suarez, D, L. (2003). Development of multiplex real-time RT-PCR as a Diagnostic Tool for Avian Influenza. Avian Diseases 47:1087-1090.
12- Suarez, D, L., Das, A., Ellis, E. (2007). Review of rapid molecular diagnostic tools for avian influenza virus. Avian Diseases 51:201-208.
13- Takimoto, S., Grandien, M., Ishida, M, A., Pereira, M, S., Paiva, T, M., Ishimaru, T., Makita, E, M., Martinez, C, H. (1991). Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay, indirect immunofluorescence assay, and virus isolation for detection of respiratory viruses in nasopharyngeal secretions. Journal of Clinical Microbiology 29:470-474.
14- Widjaja, L., Krauss, S, L., Webby, R, J., Xie, T., Robert G. Webster, R, G. (2004). Matrix gene of influenza A viruses isolated from wild aquatic birds: ecology and emergence of influenza A viruses. Journal of Virology 78(16):8771-8779.
15- World Health Organization. (2007). Guidelines on laboratory diagnosis of avian influenza. http://www.searo.who.int/LinkFiles/CDS_CDS-Guidelines-Laboratory.pdf.
16- Wu, C., Cheng, X., He, J., Lv, X., Wang, J., Deng, R., Long, Q., Wang, X. (2008). A multiplex real-time RT-PCR for detection and identification of influenza virus types A and B and subtypes H5 and N1. Journal of Virological Methods 148:81-88.
17- Zangenberg, G., Saiki, R, K., Reynolds, R. (1999). Multiplex PCR: optimization guidelines. In: PCR applications: protocols for functional genomics. Innis, M, A., Gelfand, D, H., Sninsky, J, J. Academic Press, San Diego, CA 73-94.