شناسایی پروتئین‌های راپتری4(ROP4)و انولاز2 توکسوپلاسما گوندی به عنوان آنتی ژن‌های غالب ایمنی در گوسفند

نوع مقاله: مقاله کامل

نویسندگان

1 گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم تخصصی دامپزشکی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2 بخش پروتئومیکس و بیوشیمی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، ترویج و آموزش کشاورزی، کرج، ایران.

3 گروه میکروبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، تهران، ایران.

4 بخش انگل شناسی، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران

چکیده

توکسوپلاسما گوندی (Toxoplasma gondii)، تک یاخته مهم و پاتوژن اجباری درون سلولی است که در میزبانان واسط (مهره‌داران خونگرم) ایجاد عفونت توکسوپلاسموزیس حاد و مزمن می‌نماید. توکسوپلاسموز مادرزادی در انسان و گوسفند در دوران بارداری منجر به سقط جنین می‌شود. به منظور تهیه داروهای شیمیایی و تولید واکسن موثر علیه عفونت توکسوپلاسموز و همچنین تهیه مارکرهای تشخیصی قوی و مناسب برای استفاده در تکنیک‌های سرولوژیکی، مولکولی، شناسایی پروتئین‌های تاکی زوئیت‌های توکسوپلاسما گوندی اهمیت زیادی دارد. هدف از انجام این تحقیق، شناسایی و معرفی پروتئین‌های آنتی‌ژنیک و ایمونوژنیک غالب ایمنی توکسوپلاسما گوندیی در گوسفند با استفاده از تکنیک ایمونوپروتئومیکس بود. برای تهیه تاکی زوئیت‌ها، تعداد 30 سر موش سوری (C57BL/6) ماده بالغ 7-5 هفته به انگل توکسوپلاسما گوندی آلوده شدند. پروتئین‌های تاکی‌زوئیت‌ها با روش سونیکاسیون استخراج گردید. غلظت پروتئین‌ها به روش بردفورد تعیین شد. از 10 راس گوسفند آلوده به توکسوپلاسما گوندی، سرم حاوی آنتی‌بادی ضد توکسوپلاسما تهیه گردید. مراحل الکتروفورز دوبعدی 2-DE-SDS-PAGE، وسترن بلاتینگ و ایمنوبلاتینگ اجرا شد. با انطباق دادن تصاویر ژل‌های 2-DE و ایمنوبلاتینگ، اسپات‌های مربوط به پروتئین‌های آنتی‌ژنیک و ایمنوژنیک غالب ایمنی شناسایی و مورد برش و با روش‌های مس اسپکترومتری MS/MS و MALDI-TOF/MS مورد آنالیز قرار گرفت و پروتئین‌های انولاز 2 و پروتئین راپتری 4 (ROP4) شناسایی شد. این دو پروتئین می‌توانند به عنوان مارکر‌های تشخیصی در تکنیک‌های سرولوژیکی مانند الایزا و نیز در تولید واکسن علیه عفونت توکسوپلاسموز مورد استفاده قرار بگیرند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Identification of Toxoplasma gondii ROP4 and Enolase2 Proteins as Immunodominant Antigens in Sheep

نویسندگان [English]

  • M.T. Ahady 1
  • R. Madani 2 3
  • N. Hoghooghi-Rad 1
  • A.R. Esmaeili Rastaghi 4
1 Department of Microbiology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
2 Proteomics and Biochemistry Department, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran. | Department of Microbiology, School of Specialized Veterinary Science, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
3 Proteomics and Biochemistry Department, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran. | Department of Microbiology, School of Specialized Veterinary Science, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
4 Department of Parasitology, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran.
چکیده [English]

Toxoplasma gondii is an important intracellular and obligatory protozoan that causes acute and chronic toxoplasmosis in warm-blooded hosts including sheep and humans. This infection can lead to stillbirth among pregnant women and ewes. Identification and detection of Toxoplasma gondii tachyzoites proteins especially antigenic and immunogenic proteins is crucial and essential for producing efficacious and potent drugs and vaccines against toxoplasmosis, and also for introducing efficient diagnostic markers. The aim of this study was to identify the antigenic and immunodominant immunogenic proteins of Toxoplasma gondii in sheep using immunoproteomic techniques.Thirty C57BL/6 mice (male, 5-7 weekly) were selected for providing Toxoplasma gondii tachyzoites. Proteins of tachyzoites were collected using sonication method and the concentration of the proteins was determined by Bradford method. On the other hand, ovine serum containing anti-Toxoplasma gondii antibodies was collected from 10 infected sheep. Then 2-DE-SDS-PAGE electrophoresis, western blotting and immune blotting techniques were carried out. Finally, it was specified and distinguished the spots which belonged to immunogenic and antigenic proteins on the gels, and the proteins were identified by mass spectrometry (MS/MS, MALDI-TOF/MS). The identified two proteins were enolase 2 and rhoptry protein 4 (ROP4).These immunodominant immunogenic and antigenic proteins have potential of being used as markers in serological diagnostic techniques and they may candidate vaccine against Toxoplasma gondii infection.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Toxoplasma gondii
  • Rhoptry protein4
  • Enolase2
  • Immunodominant Antigens
  • Immunoproteomics
  • Sheep

1. Ahady M.T. 2017. The study and identification of antigenic and immunodominant immunogenic proteins of Toxoplasma gondii in sheep and man using immunoproteomics procedure. PhD thesis. Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
2. Alvarado-Esquivel C., D. Silva-Aguilar, I. Villena, and J.P. Dubey. 2013. Seroprevalence and correlates of Toxoplasma gondii infection in domestic sheep in Michoacan State, Mexico. Preventive Veterinary Medicine 112:433-437.
3. Amdouni Y., M.R. Rjeibi, M. Rouatbi, S. Amairia, S. Awadi, and M. Gharbi. 2017. Molecular detection of Toxoplasma gondii infection in slaughtered ruminants (sheep, goats and cattle) in Northwest Tunisia. Meat Science 133:180-184.
4. Bahrieni M., M. Fasihi Haradani, M. Beigzadeh, H. Kamyabi, and N. Zia-Ali. 2008. Risk Factors Analysis Associated with Seropositivity to Toxoplasma gondii in Sheep and Goats in Southeastern Iran Using Modified Agglutination Test (MAT). Iranian Journal of Parasitology 3 (1):38-43.
5. Buxton D. 1998. Protozoan infections (Toxoplasma gondii, Neospora caninum and Sarcocystis spp.) in sheep and goats: recent advances. Veterinary Research 29 (3-4):289-310
6. Cenci-Goga B.T., A. Ciampelli, P. Sechi, F. Veronesi, I. Moretta, V. Cambiotti, et al. 2013. Seroprevalence and risk factors for Toxoplasma gondii in sheep in Grosseto district, Tuscany, Italy. BMC Veterinary Research 9:25.
7. Chuang S.C., J.C. Ko, C.P. Chen, J.T. Du, and C.D. Yang. 2013. Induction of long lasting protective immunity against Toxoplasma gondii in BALB/c mice by recombinant surface antigen 1 protein encapsulated in poly (lactide-co-glycolide) microparticles. Parasites & Vectors 6:34.
8. Coligan J.E., B.M. Dunn, D.W. Speicher, and P.T. Wingfield. 2003. Short protocols in protein science: a compendium of methods from protocols in protein science. John Wiley & Sons Inc., New York.
9. Dubey J.P. 2010. Toxoplasmosis of animals and humans, Second Edition. CRC Press, Taylor & Francis Group, Florida.
10. Dziadek B., J. Gatkowska, M. Grzybowski, J. Dziadek, K. Dziadek, and H. Dlugonska. 2012. Toxoplasma gondii: The vaccine potential of three trivalent antigen-cocktails composed of recombinant ROP2, ROP4, GRA4 and SAG1 proteins against chronic toxoplasmosis in BALB/c mice. Experimental Parasitology 131:133-138.
11. Fritz H.M., P.W. Bowyer, M. Bogyo, P.A. Conrad, and J.C. Boothroyd. 2012. Proteomic analysis of fractionated Toxoplasma gondii oocysts reveals clues to their environmental resistance. PloS One 7 (1):e29955.
12. Gatkowska J., B. Dziadek, A. Brzostek, D. Dziadek, K. Dzitko, and H. Dlugonska. 2010. Determination of Diagnostic Value of Toxoplasma gondii Recombination ROP2, ROP4 Antigens in Mouse Experimental Model. Polish Journal of Microbiology 59 (2):137-141.
13. Gong P., L. Cao, Y. Gue, H. Dong, S. Yuan, X. Yao, et al. 2016. Toxoplasma gondii: Protective immunity induced by a DNA vaccine expressing GRA1 and MIC3 against toxoplasmosis in BALB/c mice. Experimental Parasitology 166: 131-136.
14. Holmes M., U. Liwak, I. Pricop, X. Wang, S. Tomavo, S. Ananvoranich, et al. 2010. Silencing of tachyzoite enolase 2 alters nuclear targeting of bradyzoite enolase 1 in Toxoplasma gondii. Microbes and Infection 12:19-27.
15. Hoseininijad M., M. Shefaatifard, Y. Pirali, and H.R. Azizi. 2017. Sero-Prevalence of Toxoplasma gondii Infection in Sheep in Some Parts of Isfahan Province. Veterinary Researches & Biological Products 116:92-96.
16. Jiang W., J.X. Xue, Y.C. Liu, T. Li, X.G. Han, S.H. Wang, et al. 2016. Identification and characterization of an immunogenic antigen, enolase2, among excretory/secretory antigens (ESA) of Toxoplasma gondii. Protein Expression and Purification 127:88-97.
17. Khanmohammadi M. 2011. Seroprevalence Survey of Toxoplasma gondii Antibodies among Sheep in Tabriz District, Northwest Iran. Annals of Biological Research 2 (6): 484-488.
18. Lebrun M., V.B. Carruthers, and M.F. Cesbron-Delauw. 2014. Toxoplasma gondii, Second Edition, Chapter 12: Toxoplasma secretory proteins and their roles in cell Invasion and intracellular suvival. Elsevier: 389-453.
19. Lim S.S.Y., and R.Y. Othman. 2014. Recent Advances in Toxoplasma gondii Immunotherapeutics. The Korean Journal of Parasitology 52 (6): 581-593.
20. Ncuhoff V. 1985. Clear background and highly sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in polyacrylamide gels: A systematic analysis. Electrophoresis 6:427-448.
21. Pereira-Bueno J., A. Quintanilla-Gozalo, V. Perez-Perez, G. Alvarez-Garcia, E. Collantes-Fernandez, and L.M. Ortega-Mora. 2004. Evaluation of ovine abortion associated with Toxoplasma gondii in Spain by different diagnostic techniques. Veterinary Parasitology 121 (1-2):33-43.
22. Robert-Gangneux F., and M. Darde. 2012. Epidemiology of Diagnostic Strategies for Toxoplasmosis. Clinical Microbiology Reviews 25 (2):264-296.
23. Rua J., T. Mouveaux, S.H. Light, G. Minasov, W.F. Anderson, S. Tomavob, et al. 2015. The structure of bradyzoite-specific enolase from Toxoplasma gondii reveals insights into its dual cytoplasmic and nuclear functions. Acta Crystallographica 71:417-426.
24. Zheng B., S. Lu, Q. Tong, Q. Kong, and D. Lou. 2013. The virulence-related rhoptry protein 5 (ROP5) of Toxoplasma gondii is a novel vaccine candidate against toxoplasmosis in mice. Vaccine 31:4578-4584.