تعیین هویت مولکولی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس در بیماران استان فارس به وسیله تکنیک های RD Typing و PCR-RFLP

نوع مقاله: مقاله کامل

نویسندگان

1 گروه میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم، قم، ایران

2 آزمایشگاه رفرانس مایکوباکتریوم بیماریزای دام، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران، ایران

چکیده

بیماری سل، بیماری زئونوزی است که به عنوان یکی از مهم‌ترین بیماری‌های تهدید کننده انسان و دومین عامل عفونی در انسان می‌باشد. تمایز گونه‌های مختلف کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به روش‌های معمول زمان برو از طرفی، تشخیص دقیق جهت درمان به موقع بیماران، نقش حیاتی را ایفا می‌نماید. لذا هدف از این مطالعه، شناسایی جنس مایکوباکتریوم و تعیین هویت مولکولی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس در بیماران استان فارس به وسیله تکنیک‌های RD typing و PCR-RFLP بود. ژنوم 50 جدایه با استفاده از روش جوشاندن استخراج گردید. برای تعیین جنس این جدایه‌ها از تکنیک PCR بر اساس قطعه 16S rRNA استفاده گردید. تکنیک PCR IS6110 و تکنیکRD typing نیز به ترتیب برای شناسایی و تعیین هویت باکتری مورد استفاده قرار گرفت. در نهایت، با استفاده از تکنیک‌های RD typing و PCR-RFLP بر روی ژن oxyR جهت تعیین هویت مایکوباکتریوم‌/تعیین گونه مایکوباکتریوم انجام شد. تمامی جدایه‌ها با استفاده از تکنیک PCR برای16S rRNA باند 543 جفت باز را نمایش دادند و با استفاده ازPCR برایIS6110، باند 245 جفت باز را نمایش دادند که مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس را اثبات کردند. در تعیین هویتRD typing،RD1، RD4، RD9 و RD12 به ترتیب باندهای 146،172،235و 365 شناسایی شدندکه مشخص شد تمامی جدایه‌های مورد مطالعه گونه توبرکلوزیس می‌باشند. با استفاده از تکنیک PCR-RFLP روی ژن کاذب oxyR هویت مولکولی RD typing تایید شد. نتایج در این مطالعه نیز نشان‌دهنده قدرت تکنیک RD typing درتمایز بین مایکوباکتریوم‌ها می‌باشد و مشخص گردید تمام جدایه‌های ارسالی از شیراز، مایکوباکتریوم توبرکلوزیس هستند و مایکوباکتریوم بویس مشاهده نشد. عدم وجود گونه بویس در جدایه‌های ارسالی از شهر شیراز، نشان‌دهنده بهداشت مناسب شیر پاستوریزه در این شهر می‌باشد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Molecular Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex by RD-Typing and PCR-RFLP Method

نویسندگان [English]

  • Nooshafarin Torabi 1
  • Nader Mosavari 2
  • Razieh Nazari 1
1 Department of Microbiology, Qom Branch, Islamic Azad University, Qom, Iran.
2 Bovine tuberculosis reference laboratory, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extention Organization (AREEO), Karaj, IRAN.
چکیده [English]

Tuberculosis is still considered as one of the most important zoonotic diseases and the cause of infectious death and human casualties. The main purpose of this study was to set up and diagnose Mycobacterium tuberculosis complex isolates in patients of FARS, Shiraz using the Regions of Difference (RD) typing and RFLP techniques. The genomes of 50 isolates were extracted by boiling method. To determine the genus of the isolates, PCR technique based on 16 s rRNA was used. IS6110 PCR and RD typing were used for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex. Finally, the PCR-RFLP method was used as a comparing method for comparative evaluation of RD typing to identify mycobacteria. Amplification of 543 bp bands in 16s rRNA PCR showed that all studied isolates belonged to the genus Mycobacterium. In IS6110 gene PCR, it was shown that all isolates were Mycobacterium tuberculosis complex due to the amplification of 245 bp bands. In RD typing the identification was based on RD1, RD4, RD9 and RD12. The comparative method of PCR-RFLP on pseudo gene oxyR showed that all isolates were Mycobacterium tuberculosis. Using RD-typing, it was found that all isolates achieved from Shiraz were Mycobacterium tuberculosis. The absence of Mycobacterium bovis isolates represents good hygiene and consumption of pasteurized milk in this city. The results of this study also reflect the ability of RD typing technique in differentiation of mycobacteria.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Mycobacterium tuberculosis complex
  • RD-Typing
  • PCR 16s rRNA
  • IS6110
1. Bonard, D., P. Msellati, L. Rigouts, P. combe, D. Coulibaly, I.M. Coulibaly and F. portaels. 2000. What is the meaning of repeated isolation of Mycobacterium africanum? International Journal of Tuberculosis Lung Disease 4: 1176–1180.
2. Cole, S.T., R. Brosch, J. Parkhil, T. Garnier, C. Churcher, S. Whitehead, and B.G. Barrell. 1998. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genomesequence. Nature, 393: 537-544.
3. Cosivi, O., J. Grange, M. Daborn C J. 1998. Zoonotic tuberculosisdue to Mycobacterium bovisin developing countries. Emerg Infection Disease 4: 59–70.
4. Eramabadi M,Tadayon, K., N. Mosavari, R. Keshavarz, R. Banihashemi and Ghaderi. 2014. Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex,Using Molecular methods, mljqoums 7(5):9-15
5. Hermans, P., W D. van Soolingen. 1991. Insertion element IS987 from Mycobacterium bovis BCG is located in a hot-spot integration region for insertion elements in Mycobacterium tuberculosis complex strains. Infection Immun.59(8): 2695-705.
6. Hesseling, A C., H S. Schaaf, W A. Hanekom, et al. 2003. Danish bacille Calmette-Guerin vaccine-induced disease in human immunode- ficiency virus-infected children. Clinical Infection Disease 37: 1226– 1233.
7. Huard, R., C L C. Lazzarini. 2003."PCR-based method to differentiate the subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex on the basis of genomic deletions." J Clin Microbiol. 41(4): 1637-50.
8. Kamerbeek, J., L. Schouls, A. Kolk, M. van Agterveld, D. van Soolingen. 1997. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol 35: 907-914.
9. Mostowy, S., D. Cousins, J. Brinkman, A. Aranaz, MA .Behr. 2002. Genomic deletions suggest a phylogeny for the Mycobacterium tuberculosis complex. J Infection Disease. 186(1): 74-80.
10. Mosavari, N., M. Salehi, K. Tadayon, M. Taheri, K. Soleimani. 2007. Molecular detection of Mycobacterium bovis from Mycobacterium tuberculosis in by PCR-RFLP and comparison by standard isolation, Medical Microbiology Journal of Iran, 2,1- pages
11. Organization WHO. Global tuberculosis report 2013.
12. Ross, B.C., K. Raios, K. Jackson, B. Dwyer. 1992 . Molecular cloning of a highly repeated DNA element from Mycobacterium tuberculosis and its use as an epidemiological tool. Journal of Clinical Microbiology. (30): 942-946
13. Salfinger, M and G.E. Pfyffer. 1994. The new diagnostic mycobacteriology laboratory. European Journal of Clinical Mycobacteriology and Infections diseses. 13: 961-979
14. Sharifipour, E., MJ. Nasiri, P. Farnia, M. Mozafari, S. Irani. 2014. Evaluation of Molecular Diversity of Mycobacterium tuberculosis Strains By Polymorphisms in RD Regions. Journal Mycobacterium Disease 4: 153.
15. Tchatchouang, S., A. chokote, W. Guiewi, T. G. M. M, L. K. Sidze, E. M. Tekwu, J. C. Tedom, J. P. A. Assam, and V. N. P. Beng. 2015. Mycobacterium tuberculosis complex identification by polymerase chain reaction from positive culture in patients from Jamot and Mbalmayo district hospitals. African Journal of Biotechnology .14(11), 971-978.
16. Van Embden, J., MD. Cave, JT. Crawford, J. Dale, K. Eisenach. 1993. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology. Journal of clinical microbiology 31: 406-409.
17. Warren, R., M. N. C. Gey van Pittius. 2006. Differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex by PCR amplification of genomic regions of difference. International Journal Tuberclosis Lung Disease 10(7): 818-22.
18. WHO Global tuberculosis control: key findings from the December. 2009.
19. Warren, R,. M. T. C. Victor. 2001."Patients with active tuberculosis often have different strains in the same sputum specimen.
20. Am Journal Respir Crit Care Med, 169(5): 610-4.