بررسی بیوشیمیایی و هیستوپاتولوژیک آثار واکسن چهارتایی انتروتوکسمی در موش سوری

نویسندگان

1 موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی منطقه جنوب شرق کشور کرمان

2 موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی کرمان دانشجوی دکتری باکتری شناسی گروه پاتوبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید باهنر کرمان

3 عضو هیات علمی گروه پاتوبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید باهنر کرمان

4 عضو هیات علمی گروه بهداشت و مواد غذایی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید باهنر کرمان

چکیده

یکی از مهم ترین تست های کنترلی در مورد واکسن انتروتوکسمی تست توکسیسیتی (سنجش باقیمانده توکسین) است. ارزیابی این تست به صورت بالینی بوده و فاکتور تلفات در موش های تزریق شده ملاک قضاوت می باشد. هدف این مطالعه ارزیابی تست کنترلی توکسیسیتی در سطوح بالینی و هیستوپاتولوژیک و همچنین ارزیابی آثار واکسن انتروتوکسمی روی فاکتورهای بیوشیمیایی سرم از جمله گلوکز خون، اوره و کراتین بوده است. در این بررسی 21 سر موش سوری با میانگین وزن 25 گرم به طور تصادفی به 3 گروه جداگانه شامل گروه 1 (واکسن)، گروه 2 (کنترل) و گروه 3 (محیط کشت) دسته بندی شدند. همه موش ها قبل و بعد از تزریق از نظر فاکتورهای بالینی سلامت و تلفات کنترل شدند. گروه 1 و 3 به ترتیب واکسن انتروتوکسمی و محیط کشت پایه واکسن را به میزان 5/0 میلی لیتر به روش زیرجلدی دریافت و گروه 2 به عنوان گروه کنترل هیچ ماده ای دریافت نکردند. پس از 48 ساعت خونگیری انجام شد و ارزیابی بیوشیمیایی فاکتورهای خونی روی سرم انجام گردید. سپس هر سه گروه کالبد گشایی شده و نمونه برداری جهت مطالعات هیستوپاتولوژیک انجام گردید.  نتایج هیستوپاتولوژیک نشان داد بافت مغز در گروه واکسن (به جز دو مورد) و گروه شاهد (به جز یک مورد) و گروه محیط کشت (به جز یک مورد) دچار گلیوز کانونی شده است. بافت کبد در همه موارد گروه واکسن و در 6 نمونه گروه شاهد مبتلا به هپاتیت لنفوسیتی خفیف و نکروز و دژنره شدن خفیف سلول های کبدی بوده، در گروه محیط کشت کبد در 4 مورد طبیعی و بقیه دچار ضایعاتی شبیه گروه 1 و 2 بوده اند. کلیه ها نیز در همه گروه ها به جز یک مورد در گروه واکسن و دو مورد در گروه محیط کشت، همگی درجاتی از تغییرات اپیتلیالی خفیف را نشان دادند. قلب، طحال، روده و ریه ها در همه گروه ها سالم بودند. جهت تجزیه و تحلیل نتایج هیستوپاتولوژیک از آزمون دقیق فیشر استفاده گردید. جهت تجزیه و تحلیل داده های بیوشیمیایی از نرم افزار آماری Stata10، آزمون آماری آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تکمیلی (post hoc) شفه (scheffe) استفاده گردید. در تحلیل نتایج هیستوپاتولوژیک تفاوت معنی دار آماری بین گروه های مختلف مشاهده نگردید. تحلیل داده های بیوشیمیایی نشان دادند که تفاوت معنی داری بین مقدار گلوکز خون در گروه 1 با گروه های 2 و 3، همچنین بین مقدار اوره در گروه 1 با 3 وجود دارد  (05/0>p). بر اساس نتایج این مطالعه تزریق واکسن در موش باعث ضایعه ای مرتبط با واکسن نمی شود. با توجه به نتایج بالینی، هیستوپاتولوژیک و بیوشیمیایی نتیجه گیری می شود که فرایند تولید واکسن با دقت و به درستی انجام و تبدیل توکسین به توکسوئید که فاقد قدرت بیماریزایی است به خوبی انجام شده است و روش تست و کنترل واکسن بدون اشکال بوده است.

عنوان مقاله [English]

Histopathological and biochemical evaluation of tetravalent enterotoxemia vaccine effects in balb/C

نویسندگان [English]

  • M Ezatkhah 1
  • M Alimolaei 2
  • A Drakhshanfar 3
  • H Sharifi 4
  • M Shamsaddini Bafti 1
1 Student, Razi Vaccine and Serum Research institute-Kerman Branch, Kerman, Iran
2 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.
3 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
4 Department of Food Hygiene & Public Health, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
چکیده [English]

Clostridium perfringens, one of the most important pathogens is the main causative agent of enterotoxemia in farm animals. Vaccination is the most effective prevention method against diseases caused by Clostridium Perfringens. One of the most important testes regarding vaccine quality control is toxicity test (measuring residual toxin). The evaluation of test results was done regarding to clinical factors and mortality rate of mice that received vaccine. The present study was aimed to evaluate the toxicity test of enterotoxemia vaccine clinically, histopathologically and biochemically (BS, BUN and creatine) examinations. In this study, 21 Balb/C mouse with an average weight of 25 grams were used and divided into 3  equal groups Including group 1 (vaccine), group 2 (control) and group 3 (culture medium). Health factors and mortality rate of all mice was checked before and during the survey. Groups 1 and 3 received 0.5 ml enterotoxaemia vaccine and culture medium (without bacterium) subcutaneously, respectively and group 2 (control) did not receive any material. After 48 hrs blood sampling was done and blood biochemical factors were evaluated. Finally, animals were necropsied and histopathological studies on 3 groups were performed.  The stata10 software and Anova and scheffe tests were used for Statistical analysis. For analysis of histopathological results, Fisher test were used. Histopathological results showed focal gliosis in brain tissue in the vaccinated group (except in two cases), control group (except one) and culture medium group (except one). Liver tissues had mild lymphocytic hepatitis and mild hepatocellular degeneration and necrosis in all samples of vaccinated group, 6 samples of control group and 3 samples of culture medium group. Kidneys in all groups showed a mild degree of epithelial changes except of 1 case in vaccinated group and 2 cases in culture medium group. Heart, spleen, intestine and lungs were normal in all groups. Results showed no significant difference between groups. Also, biochemical Results showed a significant difference in amount of BS between group 1 and groups 2 and 3, as well as the amount of urea between group 1 and 3 (P < 0.05). The results of the study indicate that enterotoxemia vaccine didn’t cause a significant injury in tested mice.

 

1- Bergey´s Manual of systematic Bacteriology. (1989) Volume 2: 1179-1182.##

2- Buxton, D., Linklater, K.A. and Dyson, D.A. (1978) Pulpy kidney disease and its diagnosis by histological examination. Veterinary Record, 102, pp: 241. ##

3- Buxton, D., Morgan, K.T. (1976). Studies of the lesions produced in the brain of colostrum deprived lambs by Clostridium welchii (Clostridium perfringens) type D toxin. Journal Comparative Pathology, 86, pp: 435–47.##

4- Campbell, L.A. and Kronfeld, D.S. (1961) Estimation of low concentrations of plasma glucose using glucose oxidase. American Journal of Veterinary Research, 22, pp: 587-590. ##

5- Castex, F., Jouvert, S., Bastide, M., Corthier, G. (1994) Kinetics of appearance of intestinal lesions in mice mono-associated with a lethal or non-lethal strain of Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology, 40 (2), pp: 102–109.##

6- European Pharmacopoeia. (2012). Seventh Edition, Volume 1-2, 881.##

7- Fernandez-Miyakawa, M.E., Sayeed, S., Fisher, D.J., Poon, R., Adams, V., et al. (2007) Development and application of an oral challenge mouse model for studying Clostridium perfringens type D infection. Infection and Immunity, 75, pp: 4282–4288.##

8- Finnie, J.W. (1984) Histopathological changes in the brain of mice given Clostridium perfringens type D epsilon toxin. Journal of Comparative Pathology, 94 (3), pp: 363-70.##

9- Finnie, J.W., Hajduk, P. (1992) An immunohistochemical study of plasma albumin extravasation in the brain of mice after the administration of Clostridium perfringens type D epsilon toxin. Australian veterinary journal, 69 (10), pp: 261–262.##

10- Frerichs, G.N. and Gray, A.K. (1975) The relationship between rabbit potency test and response of sheep to clostridial vaccines. Research in Veterinary Science, 18, pp: 70-75.##

11- Gardner, D.E. (1973) Pathology of Clostridium welchii type D enterotoxaemia. Biochemical and hematological alterations in lambs. Journal Comparative Pathology, 83, pp: 499–529.##

12- Gardner, D.E. (1973) Pathology of Clostridium welchii type D enterotoxaemia Basis of the hyperglycemic response. Journal of Comparative Pathology, 83 (4), pp: 525–529.##

13- Griner, L.A. (1961) Enterotoxemia of sheep. Effects of Clostridium perfringens type D toxin on the brains of sheep and mice. American Journal of veterinary research, 22, pp: 429–442.##

14- Goldstein, J., Morris, W.E., Loidl, C.F., Tironi-Farinatti, C., McClane, B.A., et al. (2009) Clostridium perfringens Epsilon Toxin Increases the Small Intestinal Permeability in Mice and Rats. Plos One, 4(9), e7065. ##

15- Gurjar, A.A., Hegde, N.V., Love, B.C. and Jayarao, B.M. (2008) Real-time multiplex PCR assay for rapid detection and toxinotyping of Clostridium perfringens toxin producing strains in feces of dairy cattle. Molecular and cellular Probes, 22, pp: 90–95.##

16- Hartley, W.J. (1956) A focal symmetrical encephalomalacia of lambs. New Zealand veterinary Journal, 4, pp: 129–35.##

17- Hatheway, C.L., Johnson, E.A. and Aruold, E. (1998) Toply & Wilson’s Principles of bacteriology, Virology and immunity: Systematic bacteriology. Chapter 32: clostridium: the spore-bearing anaerobes. Vol 2, pp: 732-785.##

18- Heikinheimo, A. (2008) Diagnostics and molecular epidemiology of CPE-positive clostridium perfringens type A. academic dissertation, University of Helsinki, pp: 1-76.##

19- Itodo, A.E., Umoh, J.U., Adekeye, J.O., Odugbo, M.O., Haruna, G. and Sugun, M.Y. (2009). Field trial of sodium alginate-adsorbed Clostridium Perfringens types C and D toxoid against clostridial enterotoxemia in sheep. Israel Journal on Veterinary medicine, Vol, 64, No, 1.##

20- Iwao, O. and Yoshiharu O. (1984) Histopathological Effect of Botulinum C2 Toxin on Mouse Intestines. Infection and Immunity, 43 (1) pp: 54-58.##

21- Komoriya, T., Hashimoto, A., Shinozaki, A., Inoue, M. and Kohno, H. (2007) Study on Partial Purification of α-Toxin Produced from Obligate Anaerobe Clostridium perfringens. Report of the Research Institute of Industrial Technology, Nihon University, 88, pp: 1-11.##

22- Lindsay, J.A., Dennison, J.D. (1986) Histopathological effect of clostridium perfringens 8-6 enterotoxin on rabbit intestine. Current microbiology, 13, pp: 61-66.##

23- McClane, B.A. (1996) An overview of Clostridium perfringens enterotoxin. Toxicon, 34, pp: 1335-1343.##

24- Miyashiro, S., Nassar, A.F.C., Del Fava, C., Cabral, A.D., Silva, M. (2007) Clostridium perfringens types A and D associated with enterotoxemia in an 18-month-old goat. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Disease, 13, 4, pp: 885-893.##

25- Nagahama, M., Sakurai, J. (1991) Distribution of labeled Clostridium perfringens epsilon toxin in mice. Toxicon, 29 (2), pp: 211–217.##

26- Ochoa, R. and Kern, S. R. (1980) The Effects of Clostridium perfringens Type A Enterotoxin in Shetland Ponies-Clinical, Morphologic and Clinicopathologic Changes. Veterinary Pathology, 17, pp: 738-747. ##

27- Olad, G., Saadati, M., Kamali, M., Tavalaei, M., Pilechyan, R., Musavi, M. (2004) Detection and typing of Clostridium perfringens type B with PCR. Second Congress of defense against biological agents, Tehran, Iran.##

28- Orienstein, W.A., Bernier, R.H. and Hinman, A.R. (1988) Assessing vaccine efficacy in the field. Further observation. Epidemiologic Review, 10, pp: 212-241.##

29- Peat, J., Barton, B. (2005) Medical Statistics: A Guide to Data Analysis and Critical Appraisal, First edition. Blackwell Publishing Ltd. ##

30- Saadati, M., Olad, G., Kamali, M., Tavalaei, M., Pilechyan, R., Musavi, M. (2004) Detection and typing of Clostridium perfringens type C with PCR. Second Congress of defense against biological agents, Tehran, Iran.##

31- Songer, J.G. (1996) Clostridial enteric diseases of domestic animals. Clinical Microbial Review, 9(2), pp: 216-34.##

32- Suchow, M.A., Danneman, P., Brayton, C. (2001) The laboratory mouse, First Edition. Pp: 8-9. CRC Press LIC.##

33- Thrall, M.A., Weiser, G., Allison, R., Campbell, T.W. (2012) Veterinary hematology and clinical chemistry, Wiley- Blackwell LTD.##

34- Uzal, F.A. (2004) Diagnosis of Clostridium perfringens intestinal infections in sheep and goats. Anaerobe, 10, pp: 135–143.##

35- Uzal, F.A., Kelly, W.R., Morris W.E., Bermudez, J., Baiso´n, M. (2004) The pathology of peracute experimental Clostridium perfringens type D enterotoxemia in sheep. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 16, pp: 403–411.##

36- Wasinski, B. (2007) Contribution of Clostridium perfringens type A with β2 toxin gene in etiology of porcine enteric diseases. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 51, pp: 509-513.##

37- Wojdat, E., Kwiatek, K. and Kozak, M. (2006) Occurrence and characterization of some Clostridium species isolated from animal feeding stuffs. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 50, pp: 63-67.##

38- Yoo, H.S., Lee, S.U., Park, K.Y. and Park, Y.H. (1997)Molecular Typing and Epidemiological Survey of Prevalence of Clostridium perfringens Types by Multiplex PCR. Journal of clinical microbiology, 35(1), pp: 228-232.##